Il secolo dei lumi si aprì con un'innovazione decisiva e congeniale, l'introduzione di un secondo Palio delle Contrade .
Nel 1774 il Comune omologò l'organizzazione dei due Palii. Il Palio trovò anche la sua regolamentazione definitiva. Il 16 maggio 1721 il collegio di Balìa emise un bando che costituisce il moderno regolamento del Palio.
Un altro bando di questi anni sarebbe rimasto come pietra miliare nella storia del Palio. E' il bando sui nuovi confini delle Contrade promulgato nel 1729 da Beatrice Violante di Baviera, Govenatrice di Siena, per porre fine alle continue controversie tra Contrade aventi per oggetto non solo i confini tra di esse ma anche il loro numero ed entità demografica.
I cavalli erano spesso reclutati d'imperio dal Comune che talvolta per reperirne un numero adeguato obbligò tutte le Poste del circondario a mandarne almeno uno alla tratta, che dal 1761 si svolse in Comune, alla porta di Biccherna. Cavalli e cavallai di questo secolo furono raramente di nobili origini.
L'inserimento dei fantini nella nuova coreografia illuminista e nel nuovo contesto scenico del Palio risultò impossibile, quali che fossero i tentativi per omologarli al gusto del tempi. Si cercò di obbligarli a sfilare paludati sull'"asso" o soprallasso da parata. I fantini dell'epoca in realtà mal si prestavano a carmi e odi pindariche. Le Contrade già adombravano i sempre temuti "monti" o cosche segrete tra i fantini con lo scopo di manipolare l'esito delle Carriere e dividere i guadagni, ufficiali o meno che fossero.
Nel 1799 vennero a Siena, dopo l'occupazione francese, le squadracce aretine della reazione, al grido di Viva Maria. In Piazza del Campo, sui pezzi del distrutto albero della libertà, furono bruciati dieci cadaveri. Nel luglio 1799 il Palio fu sospeso per fatti gravissimi di ordine pubblico. Ma presto si capì che per l'ordine pubblico sarebbe stato più pericoloso vietare il Palio che farlo effettuare. Il drappellone con la sua Madonnna di Provenzano fu assegnato nella Carriera d'agosto. Ancora una volta il Palio era il segno che la vita della città continuava.